文章目录

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 小鼠免疫

1.3 杂交瘤细胞株构建

1.4 单克隆抗体制备及鉴定

    1.4.1 单克隆抗体制备

    1.4.2 单克隆抗体效价鉴定

    1.4.3 单克隆抗体亚型Western blotting鉴定

    1.4.4 单克隆抗体特异性鉴定

    1.4.5 单克隆抗体识别抗原表位鉴定

1.5 双抗体夹心ELISA方法的构建

    1.5.1 单抗包被浓度及抗rFgCat L1多克隆抗体稀释度筛选

    1.5.2 酶标二抗最佳稀释度筛选

    1.5.3 最适封闭液筛选

    1.5.4 显色时间筛选

1.6 双抗体夹心ELISA方法的验证

    1.6.1 敏感性

    1.6.2 特异性

    1.6.3 阴阳临界值的筛选

    1.6.4 临床样本验证

2 结 果

2.1 小鼠免疫结果

2.2 阳性杂交瘤细胞株构建

2.3 单克隆抗体制备及鉴定

    2.3.1 抗体制备结果

    2.3.2 单克隆抗体效价测定结果

    2.3.3 抗体亚型鉴定结果

    2.3.4 单克隆抗体特异性检测结果

    2.3.5 单克隆抗体识别抗原表位鉴定结果

2.4 双抗体夹心ELISA方法构建

    2.4.1 7G6包被浓度及抗rFgCat L1多克隆抗体稀释度的筛选结果

    2.4.2 酶标二抗稀释度筛选结果

    2.4.3 封闭液筛选结果

    2.4.4 显色时间筛选结果

2.5 双抗体夹心ELISA方法的验证

    2.5.1 敏感性检测结果

    2.5.2 特异性检测结果

    2.5.3 阴阳临界值筛选结果

    2.5.4 临床样本验证结果

3 讨 论

4 结 论

文章摘要:【目的】制备抗大片形吸虫组织蛋白酶L1（rFgCat L1）特异性单克隆抗体,并构建其双抗体夹心ELISA检测方法。【方法】用1 mg/mL rFgCat L1蛋白分4次对5只BALB/c小鼠进行免疫,分离小鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合构建杂交瘤细胞,筛选强阳性杂交瘤细胞株,每只小鼠腹腔注射1×10⁶个细胞制备单克隆抗体。ELISA法检测抗体效价及抗原表位,Western blotting法鉴定抗体亚型和特异性;结合抗rFgCat L1多克隆抗体构建双抗体夹心ELISA检测方法,并检测其敏感性和特异性;用建立的方法对20份阴性血清及阳性血清对照进行检测,筛选其阴阳临界值,并用47份山羊阳性血清及47份奶牛阳性血清对所构建的双抗体夹心ELISA方法进行验证。【结果】免疫后,4只小鼠血清中抗体效价均>10⁴;取小鼠脾细胞与SP2/0融合后,共筛选到8株阳性杂交瘤细胞株,其中5D5和7G6为可稳定分泌抗体的强阳性株,抗体效价分别达2⁹和2¹⁰,腹水效价分别达10⁷和10⁸。经Western blotting鉴定2株抗体均为IgG1型,轻链为Kappa型,均可特异性结合大片形吸虫排泄-分泌产物（excretory-secretory product,ESP）。由于2株抗体识别相同抗原位点,对比2株单抗的抗体效价,选择以7G6作为捕获抗体,抗rFgCat L1多克隆抗体作检测抗体构建双抗体夹心ELISA法。双抗体夹心ELISA法条件为:7G6以2μg/mL浓度包被,抗rFgCat L1多克隆抗体检测浓度为25μg/mL,酶标二抗稀释度为1∶4 000,5%脱脂奶粉封闭,显色时间为25 min。经验证,该方法可识别的最低抗原浓度为0.625μg/mL,并且可特异性识别大片形吸虫抗原。利用构建的双抗体夹心ELISA方法对阳性的奶牛和山羊血清样本进行抗原检测,抗原检出率分别为72.3%及78.7%。【结论】本研究成功制备抗rFgCat L1单克隆抗体并构建大片形吸虫病双抗体夹心ELISA检测方法,结果可为研发低成本、快速诊断试剂盒提供良好的理论依据及物质基础。

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